沙門(mén)氏菌（Salmonella）是腸桿菌科的一類(lèi)革蘭氏陰性腸道桿菌。1880年Eberth首先發(fā)現(xiàn)傷寒沙門(mén)氏菌，1885年Salmon分離到豬霍亂沙門(mén)氏菌，1988年Gartner從急性胃腸炎患者體內(nèi)分離到腸炎沙門(mén)氏菌，1900年該類(lèi)菌被命名為沙門(mén)氏菌。沙門(mén)氏菌主要寄存在畜禽體內(nèi)和蛋類(lèi)中，具有繁殖速度快、生存能力強(qiáng)等特點(diǎn)，不僅能導(dǎo)致雞白痢、雞傷寒、副傷寒等多種動(dòng)物疾病，而且每年都有很多有關(guān)沙門(mén)氏菌食物中毒事件的報(bào)道。目前，沙門(mén)氏菌中毒事件已呈全球分布，且發(fā)病率逐年上升。在世界各國(guó)的細(xì)菌性食物中毒事件中，沙門(mén)氏菌引起的食物中毒常位居榜首。我國(guó)也不例外，在我國(guó)的細(xì)菌性食物中毒事件中，70%～80%由沙門(mén)氏菌引起，而在引起沙門(mén)氏菌中毒的食品中，90%以上是肉類(lèi)等動(dòng)物源性食品，因此沙門(mén)氏菌是公共衛(wèi)生學(xué)上具有重要意義的人畜共患病的致病菌之一。
1、病原學(xué)特征
沙門(mén)氏菌為短桿菌，菌體大小（0.6～0.9）μm×（1～3）μm，兩端鈍圓，不形成莢膜和芽孢，具有鞭毛，有運(yùn)動(dòng)性，為革蘭氏陰性菌。該菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求不高，分離培養(yǎng)常采用腸道選擇鑒別培養(yǎng)基。在肉湯培養(yǎng)基中變渾濁，而后沉淀，在瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后生成光滑、微隆起、圓形、半透明的灰白色小菌落。
沙門(mén)氏菌的生化特性見(jiàn)表2-1。大多本屬菌按生化反應(yīng)分為4個(gè)亞屬。亞屬Ⅰ是生化反應(yīng)典型的和最常見(jiàn)的沙門(mén)氏菌；亞屬Ⅱ和Ⅳ是生化反應(yīng)不典型的沙門(mén)氏菌；亞屬Ⅲ是亞利桑那沙門(mén)氏菌。沙門(mén)氏菌對(duì)熱抵抗力不強(qiáng)，60℃經(jīng)15min可被殺死；對(duì)低溫有較強(qiáng)的抵抗力，在瓊脂培養(yǎng)基上于－10℃經(jīng)115d尚能存活。在水中存活2～3周。在5%的石炭酸中，5min即可死亡。在干燥的沙土中可生存2～3個(gè)月，在干燥的排泄物中可保存4年之久，在含29%食鹽的腌肉中或在6～12℃的條件下均可存活4～8個(gè)月。
沙門(mén)氏菌具有復(fù)雜的抗原結(jié)構(gòu)，一般可分為菌體（O）抗原、鞭毛（H）抗原和表面（Vi）抗原3種。
O抗原為脂多糖，性質(zhì)穩(wěn)定。能耐100℃達(dá)數(shù)小時(shí)，不被乙醇或0.1%石炭酸破壞。決定O抗原特異性的是脂多糖中的多糖側(cè)鏈部分，以1、2、3等阿拉伯?dāng)?shù)字表示。例如乙型副傷寒桿菌有4、5、123個(gè)；鼠傷寒桿菌有1、4、5、124個(gè)；豬霍亂桿菌有6、72個(gè)。其中有些O抗原是幾種菌所共有，如4、5為乙型副傷寒桿菌和鼠傷寒桿菌共有，將具有共同O抗原沙門(mén)氏菌歸為一組，這樣可將沙門(mén)桿氏菌屬分為a～z、O51～O63、O65～O67共42組。我國(guó)已發(fā)現(xiàn)26個(gè)菌組、161個(gè)血清型，使人類(lèi)致病的沙門(mén)氏菌大多屬于a～e組。O抗原刺激機(jī)體主要產(chǎn)生IgM抗體。
H抗原為蛋白質(zhì)，對(duì)熱不穩(wěn)定，60℃經(jīng)15min或乙醇處理被破壞。具有鞭毛的細(xì)菌經(jīng)甲醇固定后，其O抗原全部被H抗原遮蓋，而不能與相應(yīng)抗O抗體反應(yīng)。H抗原的特異性取決于多肽鏈上氨基酸的排列順序和空間構(gòu)型。H抗原有兩種，即第1相和第2相。H抗原刺激機(jī)體主要產(chǎn)生IgG抗體。
Vi抗原是由聚-n乙酰-D-半乳糖胺糖醛酸組成。不穩(wěn)定，經(jīng)60℃加熱、石炭酸處理或人工傳代培養(yǎng)易破壞或丟失。新從患者標(biāo)本中分離出的傷寒桿菌、丙型副傷寒桿菌等有此抗原。Vi抗原存在于細(xì)菌表面，可阻止O抗原與其相應(yīng)抗體的反應(yīng)。Vi抗原的抗原性弱。當(dāng)體內(nèi)菌存在時(shí)可產(chǎn)生一定量抗體；細(xì)菌被清除后，抗體也隨之消失。故測(cè)定Vi抗體有助于對(duì)傷寒帶菌者的檢出。
2 流行病學(xué)特征
沙門(mén)氏菌廣泛分布于自然界，人及動(dòng)物如豬、牛、馬、羊、雞、鴨、鵝等均是其宿主。少數(shù)沙門(mén)氏菌對(duì)宿主有選擇性，如馬流產(chǎn)沙門(mén)氏菌、牛流產(chǎn)沙門(mén)氏菌和羊流產(chǎn)沙門(mén)氏菌分別引起馬、牛、羊的流產(chǎn)等；豬傷寒沙門(mén)氏菌僅侵害豬；其他的沙門(mén)氏菌不需要中間宿主，很容易在動(dòng)物與動(dòng)物、動(dòng)物與人、人與人之間通過(guò)直接或間接的途徑傳播。個(gè)別血清型是在一定程度上適應(yīng)于特定動(dòng)物的偏嗜性沙門(mén)氏菌，如豬霍亂沙門(mén)氏菌和都柏林沙門(mén)氏菌，分別是豬和牛羊的強(qiáng)適應(yīng)性菌型，多在各自宿主中致病，但也能感染其他動(dòng)物。大部分血清型的沙門(mén)氏菌屬于非適應(yīng)性或泛嗜性沙門(mén)氏菌，它們具有廣泛感染的宿主譜，能引起人和各種動(dòng)物的沙門(mén)氏菌病，鼠傷寒沙門(mén)氏菌和腸炎沙門(mén)氏菌是其中的突出代表。
沙門(mén)氏菌主要傳染途徑是消化道，蛋、家禽和肉類(lèi)產(chǎn)品是沙門(mén)氏菌病的主要傳播媒介。人畜感染沙門(mén)氏菌后可呈無(wú)癥狀帶菌，也可表現(xiàn)為有臨床癥狀的致死疾病，可能加重病態(tài)，增加病死率或者降低動(dòng)物的繁殖生產(chǎn)力。其致病性主要取決于沙門(mén)氏菌的菌型和食用者的身體狀況。豬霍亂沙門(mén)氏菌致病性最強(qiáng)，其次為鼠傷寒沙門(mén)氏菌，鴨沙門(mén)氏菌致病性較弱；受威脅最大的是兒童、老人及免疫缺陷個(gè)體，即便是較少菌量或較弱致病性的菌型仍可引起食物中毒，甚至出現(xiàn)較重的臨床癥狀。
3 危害
沙門(mén)氏菌是腸桿菌科中最重要的人畜共患病的病原菌，是細(xì)菌性食物中毒中發(fā)病率最高的一種。幾乎所有血清型的沙門(mén)氏菌都具有感染性，常見(jiàn)的危害最大的有如下幾種：鼠傷寒沙門(mén)氏菌、豬霍亂沙門(mén)氏菌、豬傷寒沙門(mén)氏菌、都柏林沙門(mén)氏菌、馬流產(chǎn)沙門(mén)氏菌、雞沙門(mén)氏菌。
大部分血清型的沙門(mén)氏菌都能感染人類(lèi)。人感染沙門(mén)氏菌血清型的70%是鼠傷寒沙門(mén)氏菌和腸炎沙門(mén)氏菌，在暴發(fā)的人沙門(mén)氏菌病中，這兩個(gè)血清型感染的病例數(shù)有時(shí)可達(dá)上萬(wàn)例。由沙門(mén)氏菌引起的人類(lèi)疾病主要有傷寒和非傷寒沙門(mén)氏菌病。傷寒是由傷寒沙門(mén)氏菌引起的急性腸道傳染病，主要臨床癥狀表現(xiàn)為持續(xù)高熱、腹痛、腹瀉或便秘，白細(xì)胞數(shù)量減少，部分病人會(huì)出現(xiàn)玫瑰疹、相對(duì)緩脈等，并發(fā)腸出血、腸穿孔。全球每年因沙門(mén)氏菌引起的傷寒造成至少160萬(wàn)人發(fā)病、60萬(wàn)人死亡。非傷寒沙門(mén)氏菌病是世界范圍內(nèi)最普通的食源性疾病。如沙門(mén)氏菌胃腸炎，潛伏期為8～48h，可引起惡心、嘔吐、腹瀉、發(fā)熱、寒戰(zhàn)、頭疼等癥狀，病程一般1d或更長(zhǎng)，易感群體是兒童、老人和免疫缺陷者等。
據(jù)美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心報(bào)告，美國(guó)在1973年所發(fā)生的84起細(xì)菌性食物中毒事件中有33起是由沙門(mén)氏菌引起的，占食物中毒的首位，中毒人數(shù)為2045人。歐洲食品安全局和歐洲疾病預(yù)防控制中心發(fā)布的2018年關(guān)于人畜共患病趨勢(shì)和來(lái)源的年度報(bào)告顯示，歐盟近1/3的食源性疾病暴發(fā)是由沙門(mén)氏菌引起的，沙門(mén)氏菌病是歐盟第二大最常報(bào)告的人類(lèi)胃腸道感染（報(bào)告91857例），僅次于彎曲桿菌?。?46571例）。有些國(guó)家沙門(mén)氏菌食物中毒占細(xì)菌性食物中毒的40%以上。世界上最大的一起沙門(mén)氏菌食物中毒事件發(fā)生在1953年，瑞典人由于食用了被鼠傷寒桿菌污染的豬肉而中毒，中毒7717人，死亡90人。我國(guó)以沙門(mén)氏菌引起的細(xì)菌性食物中毒占首位。1972年青海省同仁縣發(fā)生了因圣保羅沙門(mén)氏菌污染牛肉引起的中毒事件，中毒1041人。沙門(mén)氏菌食物污染給國(guó)家造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，如1990年在我國(guó)向歐洲出口的生肉中檢測(cè)到腸炎沙門(mén)氏菌，全部銷(xiāo)毀的直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)3000萬(wàn)元，另外沙門(mén)氏菌污染嚴(yán)重是我國(guó)雞肉出口歐洲受限的主要原因；2010年美國(guó)多個(gè)州暴發(fā)由雞蛋引發(fā)的沙門(mén)氏菌疫情，共召回雞蛋5.5億個(gè)。
4 國(guó)內(nèi)外衛(wèi)生要求
國(guó)際食品法典委員會(huì)（CAC）、歐盟、澳大利亞、加拿大、日本以及我國(guó)的動(dòng)物源食品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，沙門(mén)氏菌為不得檢出的致病菌，但美國(guó)的聯(lián)邦法規(guī)中規(guī)定了在具體的動(dòng)物產(chǎn)品中可有一定比例的檢出。如碎牛肉沙門(mén)氏菌的最大陽(yáng)性檢出數(shù)為5/53，嫩雞肉沙門(mén)氏菌的最大陽(yáng)性檢出數(shù)為12/51，碎火雞肉的沙門(mén)氏菌最大陽(yáng)性檢出數(shù)為29/53。
5 檢測(cè)方法
沙門(mén)氏菌作為食品中致病菌檢測(cè)的一項(xiàng)重要指標(biāo)，在公共衛(wèi)生、食品衛(wèi)生、畜牧獸醫(yī)和口岸檢疫中都有重要的意義。目前隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，特別是免疫學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，沙門(mén)氏菌檢測(cè)從以傳統(tǒng)方法為基礎(chǔ)發(fā)展到以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的或以DNA為基礎(chǔ)的方法，并在實(shí)踐檢驗(yàn)中不斷取得新進(jìn)展。
5.1 常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法
用于檢測(cè)沙門(mén)氏菌的傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法是將食物樣品分步增菌，以增加病原菌的檢出率。這種培養(yǎng)方法總體可分為三個(gè)不同階段，即預(yù)增菌、選擇性增菌及分離步驟。傳統(tǒng)沙門(mén)氏菌檢測(cè)法全過(guò)程至少需4d才能得出明確的診斷結(jié)果。GB4789.4—2016是目前我國(guó)規(guī)定的對(duì)畜產(chǎn)品中沙門(mén)氏菌的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，主要是根據(jù)沙門(mén)氏菌的生化特性，進(jìn)行預(yù)增菌、選擇性增菌、分離培養(yǎng)、生化鑒定和血清分型。在檢測(cè)畜產(chǎn)品過(guò)程中，應(yīng)注意根據(jù)不同的樣品采取不同的檢測(cè)步驟。
5.1.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)
?。?）預(yù)增菌 稱取25g（mL）樣品放入盛有225mL緩沖蛋白胨水（BPW）的無(wú)菌均質(zhì)杯中，以8000～10000r/min均質(zhì)1～2min，或置于盛有225mL BPW的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1～2min。若樣品為液態(tài)，不需要均質(zhì)，振蕩混勻。如需測(cè)定pH，用1mol/mL無(wú)菌氫氧化鈉或鹽酸調(diào)pH至6.8±0.2。無(wú)菌操作將樣品轉(zhuǎn)至500mL錐形瓶中，如使用均質(zhì)袋，可直接進(jìn)行培養(yǎng)，于（36±1）℃培養(yǎng)8～18h。
如為冷凍產(chǎn)品，應(yīng)在45℃以下不超過(guò)15min或2～5℃不超18h解凍。
?。?）選擇性增菌 輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)過(guò)的樣品混合物，移取1mL，轉(zhuǎn)種于10mL四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液內(nèi)，于（42±1）℃培養(yǎng)18～24h。同時(shí)，另取1mL，轉(zhuǎn)種于10mL亞酸鹽胱氨酸（SC）增菌液內(nèi)，于（36±1）℃培養(yǎng)18～24h。
?。?）分離培養(yǎng) 分別用接種環(huán)取增菌液1環(huán)，劃線接種于亞硫酸鉍（BS）瓊脂平板和木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂平板（或HE瓊脂平板或沙門(mén)氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板）。于（36±1）℃分別培養(yǎng)18～24h（XLD瓊脂平板、HE瓊脂平板、沙門(mén)氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板）或40～48h（BS瓊脂平板），觀察各個(gè)平板上生長(zhǎng)的菌落，各個(gè)平板上的菌落特征見(jiàn)表2-2。
5.1.2 生化鑒定
（1）自選擇性瓊脂平板上分別挑取2個(gè)以上典型或可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂，先在斜面劃線，再于底層穿刺；接種針不要滅菌，直接接種賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，于（36±1）℃培養(yǎng)18～24h，必要時(shí)可延長(zhǎng)至48h。在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基內(nèi)，沙門(mén)氏菌屬的反應(yīng)結(jié)果見(jiàn)表2-3。
?。?）接種三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基的同時(shí)，可直接接種蛋白胨水（供做靛基質(zhì)試驗(yàn)）、尿素瓊脂（pH7.2）、氰化鉀培養(yǎng)基，也可在初步判斷結(jié)果后從營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落接種。于（36±1）℃培養(yǎng)18～24h，必要時(shí)可延長(zhǎng)至48h，按表2-4判定結(jié)果。將已挑菌落的平板儲(chǔ)存于2℃～5℃或室溫至少保留24h，以備必要時(shí)復(fù)查。
反應(yīng)序號(hào)A1：典型反應(yīng)判定為沙門(mén)氏菌屬。如尿素、氰化鉀和賴氨酸脫羧酶3項(xiàng)中有1項(xiàng)異常，按表2-5可判定為沙門(mén)氏菌。如有2項(xiàng)異常為非沙門(mén)氏菌。
反應(yīng)序號(hào)A2：補(bǔ)做甘露醇和山梨醇試驗(yàn)，沙門(mén)氏菌靛基質(zhì)陽(yáng)性變體2項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性，但需要結(jié)合血清學(xué)鑒定結(jié)果進(jìn)行判定。
反應(yīng)序號(hào)A3：補(bǔ)做β-半乳糖苷酶試驗(yàn)（ONPG）。ONPG陰性為沙門(mén)氏菌，同時(shí)賴氨酸脫羧酶陽(yáng)性，甲型副傷寒沙門(mén)氏菌為賴氨酸脫羧酶陰性。
必要時(shí)按表2-6進(jìn)行沙門(mén)氏菌生化群的鑒別。
?。?）如選擇生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)，可根據(jù)5.1.2（1）的初步判斷結(jié)果，從營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落，用生理鹽水制備成濁度適當(dāng)?shù)木鷳乙?，使用生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。
5.1.3 血清型鑒定
用營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上的單個(gè)菌落作為玻片凝集試驗(yàn)用的抗原。然后按照定型血清說(shuō)明書(shū)依次進(jìn)行O抗原、H抗原及Vi抗原的鑒定。
5.2 生化鑒定試劑盒方法
API20E試驗(yàn)條由20個(gè)含干燥底物的小管所組成。這些測(cè)定管用細(xì)菌懸浮液接種。培養(yǎng)一定時(shí)間后，通過(guò)代謝作用產(chǎn)生顏色的變化，或是加入試劑后變色而觀察其結(jié)果。
按照生化鑒定試劑盒操作說(shuō)明，將以上菌懸液加入20E反應(yīng)條的各反應(yīng)孔內(nèi)，放入反應(yīng)槽中，置37℃溫箱中培養(yǎng)24h。取出后根據(jù)說(shuō)明書(shū)觀察反應(yīng)結(jié)果，在軟件上記錄結(jié)果，系統(tǒng)將自動(dòng)出現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果。所得反應(yīng)的類(lèi)型必須以數(shù)字化形式記錄在報(bào)告單中，每3個(gè)測(cè)定為一組，每個(gè)以1、2和4標(biāo)明，在每組中，陽(yáng)性反應(yīng)以相應(yīng)的數(shù)字相加，由API20E的20個(gè)測(cè)定可得一個(gè)7位數(shù)，通過(guò)分析即可鑒定獲得細(xì)菌類(lèi)型。
5.3 分子生物學(xué)鑒定方法
用PCR進(jìn)行鑒定，亦可根據(jù)5.1.2（1）的初步判斷結(jié)果，從營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落，用無(wú)菌去離子水制成菌懸液，水浴煮沸10min，3000r/min離心5min，以上清液為模板，進(jìn)行擴(kuò)增。上游引物為：5′-GTG AAA TTA TCG CCA CGT TCG GGC AA-3′，下游引物為：5′-TCA TCG CAC CGT CAA AGG AAC C-3′。反應(yīng)體系：10×buffer5μL，TaqDNA聚合酶（2U/μL）1μL，氯化鎂溶液（25mmol/L）5μL，dNTP（2.5mmol/L）5μL，ddH2O29μL，上游引物（10μmol/L）2μL，下游引物（10μmol/L）2μL，模板1μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)，PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖在100V條件下進(jìn)行電泳，得到擴(kuò)增長(zhǎng)度為284bp的擴(kuò)增產(chǎn)物為沙門(mén)氏菌陽(yáng)性。
5.4 VIDAS鑒定方法
用可疑菌落制成菌懸液或以下方法培養(yǎng)菌液以備檢測(cè)：
?。?）預(yù)增菌 無(wú)菌方法在225mL緩沖蛋白胨水中加入25g（25mL）待檢樣品，混合混勻后，35～37℃孵育16～20h。
?。?）選擇性增菌 孵育之后，轉(zhuǎn)1mL懸液至10mLSC肉湯中（或1/10稀釋?zhuān)?5～37℃孵育6～8h。同時(shí)轉(zhuǎn)0.1mL預(yù)增菌肉湯至氯化鎂孔雀綠大豆（RVS）肉湯中，41～42℃孵育6～8h。
（3）后增菌 孵育之后，從SC肉湯中轉(zhuǎn)1mL至M肉湯，從RVS肉湯中轉(zhuǎn)1mL至另一份M肉湯。
孵育之后，混勻肉湯，從兩份M肉湯中各取1mL加入一個(gè)試管封口并在95～100℃水浴中加熱15min。冷卻后進(jìn)行VIDAS鑒定。
?。?）將所需試劑取出，使其恢復(fù)至室溫（至少30min）。
（5）每個(gè)樣品使用一條SLM（沙門(mén)氏菌）試劑條及一個(gè)SLM固相容器，先必須做好質(zhì)控和校正。確保取出試劑后，將裝有剩余固相容器的袋子重新密封好。
?。?）輸入所需的信息以便建立工作類(lèi)列表（work list），鍵入“SLM”至檢測(cè)編號(hào)，再輸入將要檢測(cè)待檢樣品的試驗(yàn)號(hào)。標(biāo)準(zhǔn)（S1）必須在work list的首位并做雙份，隨后是質(zhì)控（C1）和（C2）。
?。?）吸取500μL的質(zhì)控或樣品至SLM試劑條樣品孔。依屏幕所示，將固相容器和試劑條放入儀器的相應(yīng)位置。核對(duì)位置以確保固相容器上3個(gè)字母編碼的顏色標(biāo)記與試劑條相符。
?。?）根據(jù)操作手冊(cè)進(jìn)行檢測(cè)。所有分析過(guò)程都由儀器自動(dòng)完成。整個(gè)過(guò)程約需45min。
5.5 乳膠凝集試驗(yàn)方法
用沙門(mén)氏菌多價(jià)血清致敏乳膠制成的乳膠抗體，建立沙門(mén)氏菌乳膠凝集試驗(yàn)檢測(cè)方法。直接將可疑單個(gè)菌落涂布于玻片上，然后滴加乳膠血清，觀察其凝集情況。乳膠凝集試驗(yàn)操作簡(jiǎn)便、快速、敏感性高、特異性強(qiáng)且可用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，是一種適合基層單位用來(lái)檢測(cè)沙門(mén)氏菌的可靠方法。
5.6 ELISA方法
?。?）抗原的制備 待檢樣品在增菌液中增菌后，取1mL增菌液于離心管中，3000r/min離心10min，收集沉淀用PBS洗滌后，用少量PBS懸浮，于水浴鍋中煮沸20min，冷卻后于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
?。?）包被 在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加50μL制備的抗原，于50～60℃烘干，冷卻后，加甲醇固定5～10min，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3min。
?。?）加酶標(biāo)抗體 于各反應(yīng)孔中加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體（經(jīng)滴定后的稀釋度）50μL。37℃孵育2h，洗滌。
?。?）加底物液顯色 于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB（3，3，5，5-四甲基苯胺）底物溶液50μL，37℃孵育20min。
（5）終止反應(yīng) 于各反應(yīng)孔中加入2mol/L硫酸50μL。
?。?）結(jié)果判定 可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“＋”“－”號(hào)表示。也可測(cè)光密度（OD）值：在ELISA檢測(cè)儀上，于450nm處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值。每次試驗(yàn)設(shè)陰、陽(yáng)性和空白對(duì)照。
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